Caracterización morfológica de anormalidades nucleares de tortuga verde (Chelonia mydas) para su potencial uso como biomarcador ambiental

Abstract

Las zonas costeras del Caribe mexicano han experimentado durante las últimas décadas un crecimiento acelerado de actividades humanas, incluyendo el turismo, la urbanización y el desarrollo antrópico. Estas actividades han generado un incremento de los contaminantes ambientales, como las descargas de aguas residuales, nutrientes, metales pesados y compuestos orgánicos persistentes. Dichos contaminantes han provocado alteraciones físicas y químicas en el ecosistema marino. Adicionalmente, desde 2014 se ha registrado un arribo masivo atípico de sargazo (Sargassum natans y S. fuitans), lo cual ha provocado procesos de eutrofzación, disminución del oxígeno disponible y cambios en el pH y la temperatura del agua. Dichos efectos han afectado directamente a los organismos marinos. La tortuga verde (Chelonia mydas) es una especie ampliamente distribuida en el Caribe mexicano que fue catalogada como en preocupación menor después de décadas en las que fue considerada en peligro de extinción a nivel global. Debido a su longevidad, hábitos costeros y posición trófca, la tortuga verde es reconocida como una especie centinela para evaluar la calidad ambiental. Entre los biomarcadores utilizados para evaluar los efectos genotóxicos de la contaminación se encuentran la prueba de micronúcleos (MN) y la frecuencia de anormalidades nucleares eritrocitarias (AN), que permiten detectar daño genotóxico en células sanguíneas de forma mínimamente invasiva. La prueba de MN ha demostrado ser sensible para detectar daño en el ADN causado por agentes físicos y químicos. No obstante, la prueba tradicional requiere el conteo manual de entre 1000 y 2000 eritrocitos por individuo, lo que resulta en una técnica laboriosa y dependiente del observador. Ante esta limitación, este proyecto tiene como objetivo generar índices de alteración de membrana celular como biomarcadores tempranos de detección de condiciones medioambientales y toxicológicas, que sean sistemáticos, de alto rendimiento e independientes del observador. Se obtuvieron muestras de sangre de 166 tortugas verdes capturadas vivas entre 2015 y 2019, en cuatro sitios de estudio a lo largo de la costa de Quintana Roo: Punta Arenas, Akumal, Punta Herrero y Xcalak. Estos sitios presentan distintos grados de presión antropogénica, desde zonas relativamente conservadas (Punta Arenas y Punta Herrero), pueblos cercanos a zonas altamente contaminadas (Xcalak) y áreas con intensa actividad turística (Akumal). A partir de las muestras, se elaboraron frotis sanguíneos, los cuales fueron fjados y teñidos con naranja de acridina para su posterior análisis en microscopio de fuorescencia, donde se tomaron 20 micrografías por laminilla, por duplicado. Las morfologías consideradas para evaluar la frecuencia de AN fueron: MN, brotes nucleares, núcleos lobulados, muescas, células binucleadas, ampollas y formas en ocho. Se determinaron las frecuencias de AN y MN y se evaluaron diferencias regionales y anuales, lo que permitió identifcar distintos grados de perturbación ambiental en los que habitan las tortugas verdes. Por otro lado, para el estudio morfométrico de la membrana nuclear, se seleccionaron 60 tortugas al azar (15 por sitio) mediante un muestreo estratifcado. De cada tortuga se utilizaron 350 núcleos de eritrocitos, a los que se midieron de forma semiautomatizada ocho índices morfométricos: área, perímetro, eje mayor, eje menor, relación de aspecto, foco, circularidad y redondez. La utilidad de estos índices fue evaluada mediante estadística univariada, mediante la correlación con la frecuencia de AN observada, y de forma multivariada, mediante la evaluación de patrones regionales explicados en conjunto. Considerando que, en tortugas marinas sanas, los eritrocitos presentan núcleos elípticos, en este estudio se evaluaron las desviaciones respecto a la forma elíptica asociadas a anormalidades nucleares mediante un modelo no paramétrico basado en la relación entre la relación del aspecto (AR) y el Foco (FD). Para ello, se aplicó un análisis de regresión no lineal por sitio de estudio, utilizando el modelo paramétrico de la ecuación general de una cónica. Los resultados del análisis genotóxico mostraron que el 98.8% de las tortugas evaluadas presentó daño en el ADN, evidenciado por la presencia de MN y AN. La frecuencia de AN fue mayor en Xcalak y Akumal que en el resto de los sitios (p < 0.01) mientras que Punta Arenas presentó los valores más bajos. Además, se encontraron diferencias estadísticamente signifcativas en la frecuencia de AN entre los años de estudio con un incremento anual desde el 2015. Estos resultados, junto con la falta de correlación (p > 0.05) entre la frecuencia de AN y las variables biológicas (talla, sexo y clase de edad) demuestran la sensibilidad de la prueba como biomarcador ambiental. Los análisis morfométricos respaldaron los resultados obtenidos con la prueba de MN tradicional, demostrando que los núcleos eritrocitarios de tortugas verdes que habitan en sitios con mayor presión antropogénica (Xcalak y Akumal) presentaron una reducción signifcativa del área nuclear y una desviación de la forma elíptica, considerada normal para eritrocitos maduros. A su vez, los índices (medición automatizada) mostraron correlaciones signifcativas con la frecuencia de múltiples anormalidades (medición visual). Los análisis multivariados y modelación permitieron diferenciar a los individuos de Xcalak de los de otros sitios, principalmente debido a la disminución del área nuclear y a la morfología irregular de los núcleos. En contraste, las tortugas de Punta Arenas presentaron núcleos eritrocitarios de mayor tamaño y morfología elíptica. Así mismo, en el modelo no paramétrico de AR y F, los datos de Punta Arenas y Punta Herrero se ajustaron a un modelo elíptico, indicando núcleos morfológicamente normales. En contraste, los núcleos de Akumal y Xcalak mostraron desviaciones del modelo elíptico y se ajustaron a formas hiperbólicas, lo que sugiere que los núcleos de esta zona presentan mayor frecuencia de presencia de núcleos anormales. Este estudio demuestra que los índices morfométricos nucleares obtenidos mediante análisis de imágenes constituyen biomarcadores efcaces y objetivos para la detección temprana de daño genotóxico en tortugas verdes del Caribe mexicano. En particular, la disminución del área nuclear y las desviaciones de la forma elíptica de los núcleos, mostraron una alta sensibilidad para discriminar las poblaciones con mayor daño genotóxico y siendo consistentes con la frecuencia de MN y AN. Por lo tanto, los índices de morfología de la membrana nuclear, así como el modelo entre AR y F se consideran como una herramienta objetiva y efciente para el análisis ecotoxicológico y con alto potencial para su implementación en otras especies con eritrocitos nucleados.

Tourism, urban development, and sargasso beaching caused environmental alterations in the Mexican Caribbean coasts. Little ecotoxicological information exists on the green turtle (Chelonia mydas) population inhabiting this region. Micronucleus (MN) and erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) tests are non-destructive DNA damage biomarkers. We aimed to determine local (Punta Arenas, Akumal, Punta Herrero, and Xcalak) and annual (2015–2019) variability in MN/ENA frequency to understand genotoxic damage extent. Almost all the individuals sampled (n = 166) presented DNA damage (98.8%); the lack of correlations between MN/ENA and biological variables confrmed the usefulness of these tests as biomarkers. The southern foraging site had the highest number of MN/ENA; an increase over time was found in the most urbanized and the most protected sites, coinciding with previously reported regional variability of persistent organic compounds, heavy metals, and annual massive infux of sargasso. Considering the sentinel status of green turtles, the advantages of the blood tests, and the continuous accelerated urban development in the Caribbean, long-term monitoring of this species is advised.