Reposicionamiento computacional y evaluación funcional de nuevos inhibidores de la proteína Peptidil arginina deiminasa tipo IV

Abstract

El descubrimiento de nuevos inhibidores para proteínas específicas es crucial en la investigación farmacológica, especialmente en enfermedades autoinmunes, donde la desregulación de proteínas como la PAD4 (Peptidil Arginina Deiminasa Tipo IV) juega un papel fundamental. PAD4 cataliza la conversión de residuos de arginina en citrulina, una modificación postraduccional que altera la carga y función de las proteínas blanco, como las histonas. Esta modificación promueve la descondensación de la cromatina y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs), un proceso conocido como NETosis, que se ha implicado en la fisiopatología de enfermedades como la artritis reumatoide. Considerando la ausencia de inhibidores clínicamente aprobados para PAD4, se adoptó un enfoque de reposicionamiento de farmacos asistido por computadora, complementado con validación funcional in vitro y ex vivo, con el objetivo de explorar compuestos con potencial terapéutico. En la fase computacional, se aplicó la estrategia acoplamiento molecular (“docking molecular) para predecir la afinidad de unión entre compuestos y su blanco PAD4. Se llevó a cabo un cribado virtual de 16,424 moléculas provenientes de las bases de datos REFRAME y ZINC15, utilizando como receptor la proteína PAD4 en su estructura cristalográfica (PDB ID: 4DKT). El análisis de docking molecular se basó en la afinidad de unión del inhibidor TDFA (–5.8 kcal/mol), y se seleccionaron aquellos compuestos que presentaron valores de afinidad iguales o superiores. A partir del análisis estructural, de afinidad de unión y disponibilidad comercial, se seleccionaron tres compuestos para su validación experimental: ácido fólico, amodiaquina y piroxamida. A nivel molecular, estos compuestos mostraron interacciones favorables con residuos catalíticos clave (D350, H471, D473 y C645), y su estabilidad estructural fue confirmada mediante simulaciones de dinámica molecular de 100 ns. Dichas simulaciones evidenciaron perfiles estables en términos de RMSD (desviación cuadrática media) y RMSF (fluctuación cuadrática media), así como una alta frecuencia de formación de puentes de hidrógeno en el caso del ácido fólico. Como primer paso, se evaluó la viabilidad celular en células mononucleares y polimorfonucleares humanas mediante tinción con ioduro de propidio, con el fin de descartar efectos citotóxicos inducidos por los compuestos. Los resultados mostraron que ninguno de los fármacos afectó la viabilidad de los neutrófilos durante los primeros 135 minutos, mientras que la amodiaquina mostró toxicidad en células mononucleares únicamente a concentraciones elevadas (≥50 μM), efecto también observado con BB-Clamidina. Estos datos permitieron establecer un rango seguro de concentraciones para ser utilizado en los ensayos de actividad enzimática de PAD4 y en el modelo ex vivo de NETosis, con el objetivo de evaluar los efectos específicos de los compuestos evitando interferencias por toxicidad celular. En los ensayos funcionales in vitro, amodiaquina (1 nM) y piroxamida (0.1 μM) inhibieron la actividad enzimática de PAD4 de forma más eficiente que el inhibidor de referencia BBCl- amidina (8.8 μM), con reducciones del 14.3 % y 12.7 %, respectivamente. El ácido fólico mostró un efecto inhibitorio moderado (9.2 %), aunque también superior al compuesto control (7.5 %). En el modelo ex vivo de NETosis inducida con A23187, los tres compuestos alteraron la morfología nuclear de los neutrófilos y redujeron la descondensación de cromatina. La amodiaquina, en particular, disminuyó significativamente el área y el perímetro nuclear, un efecto comparable al observado con BBCla. Por su parte, el ácido fólico y la piroxamida también mostraron interferencia en el proceso de NETosis, aunque en menor grado. En conjunto, este estudio demuestra que la integración de herramientas computacionales con ensayos biológicos funcionales permite identificar nuevos inhibidores de PAD4 con potencial aplicación terapéutica. Los resultados posicionan a la amodiaquina, el ácido fólico y la piroxamida como candidatos prometedores para modular procesos inflamatorios mediados por citrulinación y NETosis. No obstante, se requieren estudios adicionales, como curvas dosis-respuesta, evaluaciones preclínicas y análisis de seguridad a largo plazo, para avanzar hacia su posible uso clínico

Peptidylargininedeiminase4(PAD4) is aproteinthatcatalyzesbothnormal andabnormalcitrullinationof interacting proteinpartners,affecting genmodiaquine,folicacid,andpyroxamideasstablePAD4 binders. In vitro inhibitionassaysrevealedthatamodiaquine(5.0 !M to1.0nM)andpyroxamide(0.1 !M) were morepotentinhibitorsthanthereferencePAD4inhibitorBBCla(8.8 !M),whilefolicacidshowedanon- significant trendtowardinhibition. Cytotoxicityassaysconfirmedthatall compoundswerenon-toxicatthe tested concentrations,exceptforamodiaquineat50 !M. NETosisassaysdemonstratedthatthethreeselected compoundsalteredchromatindecondensationandcellularmorphologysimilarlytoBBCla,althoughnot uniformlyacrossallcells.Overall,amodiaquine,folic acid, andpyroxamidewereidentifiedasPAD4inhibitors throughcombinedvirtualandexperimentalapproaches,supportingtheirpotentialastherapeuticcandidatesfor PAD4-relateddiseasesandwarrantingfurtherinvestigation.