Importancia de Gpn3 en la sensibilidad de la levadura Saccharomyces cerevisiae a inhibidores de la síntesis de proteínas

Abstract

Gpn3 es una proteína esencial, miembro de la familia de las GTPasas GPN. Gpn3 cumple una función fundamental dentro de la célula, porque la deleción del gen que la codifica impide el crecimiento y la proliferación celular. Tanto en células humanas como en la levadura Saccharomyces cerevisiae las proteínas Gpn1, Gpn2 y Gpn3 cumplen una función crítica en el proceso de ensamblaje e importación nuclear de la RNA polimerasa II (RNAPII), la enzima responsable de transcribir los genes que codifican para proteínas en las células eucariotas, entre otros. Anteriormente, en nuestro grupo de trabajo se realizaron diversos estudios con cepas de S. cerevisiae que sintetizan únicamente versiones hipomórficas de NPA3, el gen ortólogo de GPN1 en humanos. Estas cepas hipomórficas para NPA3 han mostrado fenotipos de lento crecimiento, así como una retención parcial de RNAPII en el citoplasma, y un aumento en el tamaño de la célula. Entre los hallazgos novedosos de nuestro grupo se identificó que las cepas con pérdida parcial de función npa3C, npa3k16r y npa3g70a mostraron un aumento en la sensibilidad a los inhibidores de la síntesis de proteínas higromicina B y geneticina, lo que, aunado a otros resultados, nos permitió hacer la propuesta de que Npa3 participa de alguna manera en el proceso de síntesis de proteínas. Gpn3 está constituida por 272 aminoácidos y tiene un peso molecular de 30 kDa, y al ser una proteína esencial su función celular puede inhibirse solo de manera parcial mediante mutaciones. Ya que tanto Npa3 como Gpn3 son necesarias para la acumulación nuclear de la RNAPII, y ambas se asocian físicamente entre sí, en este trabajo se investigó la hipótesis de que el crecimiento de las cepas que expresen versiones hipomórficas de GPN3 también mostrarán una mayor sensibilidad a una inhibición en la síntesis de proteínas. En este proyecto se generaron cepas hipomórficas para GPN3 y se investigó si alguna de éstas era más sensible a la higromicina B y a la geneticina que la cepa que expresa GPN3 silvestre. Para lograr nuestro objetivo trabajamos con células de levadura que sintetizan Gpn3 únicamente a partir de un plásmido de mantenimiento; esto debido a que el gen endógeno GPN3 se inactivó por recombinación homóloga. El plásmido de mantenimiento que expresa GPN3 silvestre fue sustituido posteriormente por un plásmido que expresa una de las siguientes versiones hipomórficas de GPN3: gpn3-1.1, gpn3-1.2, gpn3.3, gpn3-1, gpn3-9 o gpn3-10. Posteriormente se determinó la velocidad de crecimiento de dichas cepas en ausencia o en presencia de diversas concentraciones de higromicina B o geneticina. Nuestros ensayos de proliferación mostraron que la exposición a higromicina B (90 μg/ml) disminuyó la proliferación de la cepa gpn3-1, y más fuertemente la de gpn3-9, sin afectar la proliferación de la cepa GPN3 silvestre. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Félix et. al. (2024) que expresan solo una versión hipomórfica de Npa3, confirmando la fuerte relación funcional entre ambas GTPasas, y abriendo un nuevo camino para el estudio de Gpn3 y su posible participación en el complejo proceso de síntesis de proteínas.