Generación y caracterización de un clon infeccioso del virus de ZIKV que contenga un gen reportero fluorescente

Abstract

Introducción: El virus del Zika (ZIKV) es transmitida principalmente por la picadura de mosquitos del género Aedes. Actualmente se han reportado casos de fiebre por Zika en más de 80 países y aunque la mayoría de los casos de infección son asintomáticos, se ha asociado esta enfermedad con otros padecimientos tales como malformaciones congénitas en el Sistema Nervioso Central (p.ej. microcefalia), fiebre hemorrágica, y Síndrome de Guillain-Barré. Al ser parte de la familia Flaviviridae, presenta una alta similitud génica y estructural con los virus de dengue, de la fiebre amarilla y del oeste del Nilo. El genoma del ZIKV tiene un tamaño aproximado de 10.7 kb y se compone de una cadena simple de RNA de polaridad positiva [(+) ssRNA]. En el área de investigación biomédica, para determinar la carga viral se realizan ensayos de RT-qPCR, pero para determina la infectividad es necesario realizar ensayos de placa o inmunoquímica. Sin embargo, estas técnicas no son útiles cuando se quiere caracterizar la infección viral en cultivos celulares complejos donde hay varios linajes celulares, o cuando se quiere realizar cinéticas de infección sin tener que fijar las células. Es por ello, que en este proyecto desarrollaremos un clon infeccioso del ZIKV de la cepa asiática que exprese un gen reportero y que tenga la misma infectividad que el virus silvestre. Metodología: Se modificó con un plásmido que contiene el genoma completo del ZIKV del linaje asiático realizando la inserción de la proteína verde fluorescente en una sección no estructural del genoma del ZIKV mediante una técnica de recombinación homóloga. Una vez realizada la clonación e inserción del gen reportero se determinó si dicha mutación alteró la infectividad del virus mutante con respecto al silvestre por medio de ensayos de placa y microscopía de fluorescencia. Conclusión: La inserción de un gen reportero dentro de la sección no estructural del plásmido del virus de ZIKV inhibió la replicación viral; el gen reportero no se expresó y las células transfectadas con el clon no presentaron el efecto citopático clásico de la infección por ZIKV, así como tampoco resultó en muerte celular. Por lo tanto, se deberán evaluar nuevos sitios de inserción del gen fluorescente.