Efecto del factor alfa en los niveles proteicos y distribución subcelular de la GTPasa Npa3 en la levadura Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Al igual que en los eucariotas superiores, el ciclo celular de la levadura se divide en cuatro fases independientes: G1, S, G2 y M. Existen diferentes métodos que han sido utilizados en la levadura Saccharomyces cerevisiae para arrestar las células y liberarlas de manera sincrónica en diferentes etapas del ciclo celular. Uno de ellos es el uso de péptidos como, el factor α, que permite arrestar las células en la fase G1, o el uso de fármacos, como el nocodazol, que bloquea a las células en la fase G2/M del ciclo celular, entre otros. El reinicio de la proliferación celular, después de la eliminación del factor α, requiere de la activación de un programa transcripcional que involucra una gran cantidad de genes y la progresión por el punto de control “start”. En esta fase la célula se compromete a un nuevo ciclo de división celular, lo que es seguido rápidamente por el inicio de la replicación del DNA, la formación de la yema y eventualmente por la formación del huso mitótico responsable de la segregación del material genético en las dos células hijas. Los resultados obtenidos por Alonso y colaboradores (2011), indican que una disminución en la expresión de Gpn1/Npa3 compromete la progresión del ciclo celular con un importante retraso en la fase S, en comparación con células que expresan la versión silvestre de esta proteína. Gpn1 forma parte de un grupo de GTPasas llamado Gpn, el cual incluye tres miembros: Gpn1, Gpn2 y Gp3. Las tres proteínas son esenciales y conservadas en todos los organismos eucariontes. La función mejor descrita para Gpn1 es participar en el transporte al núcleo de la RNA polimerasa II y favorecer su concentración en este organelo. Npa3 es el ortólogo en Saccharomyces cerevisiae de Gpn1 humana. En nuestro grupo de trabajo, Guerrero Serrano y colaboradores (2017) demostraron que la ausencia del extremo C-terminal de Npa3 (npa3ΔC) en la cepa de S. cerevisiae ClaI, impide el reinicio del ciclo celular después del arresto con el factor α hasta 50 minutos posterior al retiro de este péptido en el cultivo, comparado con las células que expresan la versión silvestre de Npa3, las cuales rápidamente reinician la proliferación. Otro hallazgo importante fue que en células de S. cerevisiae arrestadas con el factor α la fluorescencia de la proteína npa3ΔC-GFP disminuyó drásticamente como resultado de la exposición de las células a este péptido durante 2 horas. Este efecto fue reversible y la fluorescencia se recuperó conforme pasó el tiempo después de lavarlo. Estos hallazgos sugieren que el reinicio de la proliferación celular después del arresto en G1 producido por el factor α en las células de levadura S. cerevisiae se asocia con un aumento en la concentración de la proteína Npa3. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar en la cepa de S. cerevisiae BY4741, utilizada más comúnmente que la ClaI, los niveles proteicos y la localización subcelular de la GTPasa Npa3 antes, durante y después de la liberación del arresto en el ciclo celular inducido por el factor α. Se anticipa que el reinicio de la proliferación celular, después del arresto en G1 producido por el factor α, se asocie con un aumento en los niveles proteicos y una posible acumulación nuclear de la GTPasa Npa3. Para determinar el reinicio del ciclo celular posterior al arresto en la fase G1 utilizando el factor α en la cepa de S. cerevisiae BY4741, las células se arrestaron en presencia del factor α a una 6 concentración final de 5-10 μg/ml durante 2 horas y se evaluó el cambio en la intensidad de fluorescencia mediante un curso temporal de 0-2 horas antes y posterior a la incubación con el factor α por microscopia, en las células que expresaron la GTPasa silvestre (Npa3-GFP) y la versión carente del extremo C-terminal (npa3ΔC-GFP). Nuestros resultados no mostraron cambios en la intensidad de fluorescencia de la proteína Npa3-GFP o npa3ΔC-GFP antes o posterior al arresto del ciclo celular con el factor α en ninguno de los tiempos evaluados. La localización subcelular de la GTPasa Npa3-GFP se identificó en el citoplasma en las células que expresaron la proteína silvestre. Estos resultados obtenidos en la cepa BY4741 contrastan con los obtenidos previamente en la cepa ClaI, donde se observó esa disminución de la fluorescencia en la proteína npa3ΔC-GFP después de arrestar las células con el factor α. Es posible que estas diferencias tengan una relación directa con el fondo genético de las cepas utilizadas como modelo experimental.