Elucidando el mecanismo de interacción entre el receptor tipo cinasa CRK10 y el transportador de poliaminas AtPUT2

Abstract

Las plantas, como organismos sésiles, han desarrollado complejas vías de transducción de señales para percibir y responder a estímulos ambientales. Los receptores tipo quinasa (RLKs) son componentes centrales de estas vías, vinculando señales ambientales a respuestas intracelulares. Aunque se ha identificado un gran número de receptores RLK en los genomas de plantas, sus ligandos que reconocen, sus funciones particulares y las proteínas con las que interactúan, incluyendo proteínas de membrana, solo han sido descritos en pocos casos. En este estudio investigamos el mecanismo de interacción entre el receptor tipo quinasa rico en cisteína AtCRK10 y el transportador de poliaminas de Arabidopsis thaliana AtPUT2, dos proteínas implicadas en la respuesta de defensa de las plantas. En particular nos enfocamos en determinar cuál de los tres dominios de AtCRK10, el extracelular, el transmembranal y el intracelular quinasa, interactúa in planta con la proteína AtPUT2, utilizando la técnica de Complementación Bimolecular de Fluorescencia (BiFC) en células de hoja de tabaco. Los análisis de BiFC mostraron que AtPUT2 puede interactuar con los dominios extracelulares y la quinasa de AtCRK10. Interesantemente, esta interacción depende de que el dominio quinasa sea funcional, ya que una variante que generamos mediante una mutación puntual en el ácido aspártico conservado, diseñada para inactivar la actividad quinasa en la proteína completa de AtCRK10, no produjo señal de fluorescencia, lo que sugiere una pérdida de la interacción. Por otra parte, la caracterización preliminar de líneas reporteras promCRK10::GFP-GUS y promCRK10::CRK0-GFP-GUS mostró que AtCRK10 se expresa en las hojas de la roseta, particularmente en las células guarda de los estomas, mientras que el uso de las reporteras promPUT2::GFP-GUS y promPUT2::PUT2-GFP-GUS mostró que el gen AtPUT2 también se expresa en hojas de la roseta. Proponemos un modelo en el que la activación del receptor AtCRK10 tras la detección de patógenos podría inducir su homodimerización y autofosforilación, lo que favorecería su interacción con el transportador AtPUT2 a través de sus dominios extracelular y quinasa. Esta interacción AtCRK10-AtPUT2 podría inducir el transporte de poliaminas en respuesta al ataque de patógenos.

Plants, as sessile organisms, have evolved intricate signal transduction pathways to perceive and respond to environmental stimuli. Receptor-like kinases (RLKs) are central components of these pathways, linking external cues to intracellular signaling. Although a vast number of receptors have been identified in plants´ genomes, their recognized ligands, specific functions, and interaction partners, including membrane proteins, have not been fully described. In this study, we investigate the interaction mechanism between the cysteine-rich receptor-like kinase AtCRK10 and the Arabidopsis thaliana polyamine transporter AtPUT2, both of which are implicated in plant immune responses. Particularly, we focus on determining which of the protein domains of AtCRK10, the extracellular, transmembrane, and intracellular kinase domains, interact with the AtPUT2 protein through Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in tobacco leaves. BiFC assays revealed that AtPUT2 interacts with the cytoplasmic kinase domain and the extracellular domain of AtCRK10. Interestingly, this interaction depends on a fully functional kinase domain; a death-kinase variant, obtained by a point mutation in the conserved aspartic acid that abolishes the kinase activity of the AtCRK10 protein, failed to produce a fluorescence signal, suggesting a loss of interaction. Moreover, preliminary characterization of reporter lines promCRK10::GFP-GUS and promCRK10::CRK0-GFP-GUS showed that AtCRK10 is expressed in rosette leaves, particularly in the guard cells of the stomata, while the evaluation of promPUT2::GFP-GUS and promPUT2::PUT2-GFPGUS reporter lines showed that AtPUT2 is also expressed in rosette leaves. We propose a model in which activation of AtCRK10 upon pathogen perception might induce its homodimerization and autophosphorylation, thereby facilitating its interaction with the AtPUT2 transporter through its extracellular and kinase domains. This AtPUT2-AtCRK10 interaction could induce polyamine transport upon pathogen activation.