Generación de un sistema de partículas similares a SARS-CoV-2 para la implementación de bioensayos de entrada viral

Abstract

El brote de COVID-19, causado por el virus SARS-CoV-2, fue un evento dramático para la salud mundial desde su origen en Wuhan, China, en diciembre de 2019. La rápida propagación llevó a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a declararla una pandemia en marzo de 2020. Desde entonces, diversos esfuerzos se han enfocado en el desarrollo de vacunas, antivirales y herramientas que permitan conocer al virus en detalle. En este contexto, las partículas similares a virus (VLPs) representan una herramienta virológica muy atractiva. Las VLPs son complejos macromoleculares autoensamblados, generados a partir de las proteínas estructurales del virus de interés; dichas partículas carecen del material genético necesario para replicarse, lo que permite su manipulación segura en laboratorios BSL-1, además de contar con distintas aplicaciones biomédicas y como potenciales vacunas. Diversas plataformas de VLPs de SARS-CoV-2 ya han sido reportadas; sin embargo, su producción a menudo requiere la co-transfección de dos hasta cuatro plásmidos, lo que puede ser ineficiente. El presente trabajo se centra en el desarrollo de un sistema de producción de VLPs de SARS-CoV-2 a partir de un solo plásmido que contiene los genes de las cuatro proteínas estructurales de SARS-CoV-2 (proteínas E, M, N y S), con el objetivo de simplificar y mejorar la eficiencia del proceso de transfección. Dichas VLPs también serían capaces de empaquetar selectivamente el RNA mensajero de un gen reportero. Los resultados de: transfecciones transitorias en células HEK293-T con los plásmidos diseñados en este trabajo, análisis inmunológicos, análisis de dispersión de luz dinámica y microscopia electrónica de trasmisión de secciones ultrafinas mostraron las dificultades asociadas al ensamblaje y la vía de egreso de las VLPs. En resumen, este estudio destaca la importancia de la continua investigación en el campo de las VLPs con el fin de desarrollar herramientas que permita el estudio de los virus emergentes como el SARS-CoV-2.

The outbreak of COVID-19 that led to a global pandemic in March 2020 led to a rapid development of vaccines, antivirals, and tools that allowed the study of the novel coronavirus SARS-CoV-2. In this context, virus-like particles (VLPs) represent an attractive tool for studying a virus. Virus-like particles are auto-assembled macromolecular protein complexes generated only from the structural proteins of the wild-type virus of interest. These particles lack the genetic material necessary for viral replication, and in consequence, they can be safely manipulated in BSL-1 laboratories. SARS-CoV-2 VLPs have already been reported, but in most cases, their assembly requires the co-transfection of 2 up to 4 plasmids which hinders the attainment of high production yields. In this work, we aimed to generate a system of a single polycistronic plasmid coding for the E, M, N, and S structural proteins of SARS-CoV-2 that allows the production of SARS-CoV-2 VLPs capable of packaging the messenger RNA from a reporter gene. The results of the transient transfection on HEK-293T cells with the plasmids obtained in this work, as well as the results of the characterization of the VLPs, revealed the difficulties inherent in the assembly and egress of VLPs. In conclusion, this work highlights the relevance of the ongoing research on the VLP production process, to obtain a virologic tool that allows the study of viruses of interest and emerging viruses.