Nanopartículas de oro encapsidadas por bromovirus e hinchamiento viral como mecanismo para la entrega de genes a la maquinaria celular

Abstract

El concepto de nanotecnología surgió desde el año 1959, donde el Dr. Richard Feynman habló por primera vez sobre la posibilidad de manipular átomos y moléculas, pero no fue hasta 1970 que el Dr. Norio Taniguchi utilizó el termino nanotecnología para describir sus investigaciones, la nanotecnología se puede definir como el estudio y la manipulación de la materia a escala nanométrica (1-100nm). A su vez, la nanomedicina promete innumerables soluciones y avances tecnológicos. Para un mejor entendimiento de este proyecto fue divido en cuatro capítulos, el primero de ellos se basó en las síntesis de nanopartículas metálicas, esta área ha tenido un gran énfasis e interés, debido a las propiedades que estas presentan a causa del cambio en sus características en escala nanométrica, en este proyecto se trabajó con tres diferentes nanopartículas de oro (AuNPs), las cuales fueros las nanoesferas de oro (AuNEs), nanopartículas de plata (AgNPs) y nanoshells de oro (AuNSs), logrando la síntesis y caracterización, mediante dispersión de luz dinámica (DLS), Microscopio electrónico de transmisión (MET) y espectrofotometría Uv-vis, también se realizó un estudio de la estabilidad que estas poseen con respecto al tiempo, donde se demostró que las AUNEs muestran una mayor estabilidad con respecto a las AgNPs y AuNSs. El segundo capítulo del proyecto es un estudio de los mecanismos de entrada de las AuNEs con respecto al tiempo en células HEK-293, ya que un aspecto importante a considerar cuando se trabaja con nanopartículas es la interacción que existe con las células, en específico el conocer el mecanismo de absorción de las nanopartículas. Dos procesos fundamentales a la hora de evaluar si existe efectos citotóxicos celulares causados por las nanopartículas son la endocitosis y exocitosis, se optó por el uso de AuNEs debido a las características que se observaron en el capítulo I. La tercera etapa del proyecto se basó en la encapsidación de las nanopartículas sintetizadas en el capítulo I con la cápside del virus de planta CCMV, esto con el fin de poder utilizar la cápside viral de los virus como nanocontenedores para las AuNPs dándoles una mayor biocompatibilidad, durabilidad y estabilidad, para que puedan ser utilizadas en terapias biomédicas. La última etapa del proyecto lleva por nombre estudio del proceso de hinchamiento de los virus Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV) y Brome Mosaic Virus (BMV), en esta etapa del proyecto primeramente se llevó a cabo la amplificación y purificación de los virus CCMV y BMV, posteriormente se realizó la evaluación de los cambios del diámetro de la cápside viral, cuando se expone a diferentes condiciones de pH y fuerza iónica (FI), estos estudios surgieron a partir de la pregunta ¿cómo es que la cápside protege al genoma viral de los cambios de pH y FI que va encontrando en su camino? Es decir, desde que el virus entra al hospedero y llega a la célula hay diferentes condiciones fisicoquímicas de pH y FI, existen antecedentes que han demostrado que los virus sufren una hinchazón, que anteriormente se creía que era de un 10% en la cápside viral, debido a este incremento en el tamaño, surge la hipótesis de que los extremos 5`y 3`del material genético quedan expuestos, esto daría la posibilidad a la maquinaria celular de tomar el RNA y seguir con la replicación. Por eso razón el CCMV y BMV se sometieron a diferentes condiciones de pH y FI, los cuales fueron evaluados por DLS, MET y microscopia de fuerza atómica (AFM), donde se demostró que las cápsides virales tienen un hinchamiento superior al 10% reportado con anterioridad en la literatura.

The concept of nanotechnology emerged in 1959, where Dr. Richard Feynman first spoke about the possibility of manipulating atoms and molecules, but it was not until 1970 that Dr. Norio Taniguchi used the term nanotechnology to describe his research, Nanotechnology can be defined as the study and manipulation of matter at the nanometer scale (1-100nm). At the same time, nanomedicine promises countless solutions and technological advances. For a better understanding of this project, it was divided into four chapters, the first of which was based on the syntheses of metal nanoparticles, this area has had greater emphasis and interest, due to the properties that they present due to the change in their characteristics. On a nanometric scale, in this project we worked with three different gold nanoparticles (AuNPs), which were gold nanospheres (AuNEs), silver nanoparticles (AgNPs) and gold nanoshells (AuNSs), achieving the synthesis and characterization, Using dynamic light scattering (DLS), Transmission Electron Microscope (MET) and UV-vis spectrophotometry, a study of the stability that these possess with respect to time was also carried out, where it was demonstrated that the AUNEs show greater stability with respect to two AgNPs and AuNSs. The second chapter of the project is a study of the entry mechanisms of AuNEs with respect to time in HEK-293 cells, since an important aspect to consider when working with nanoparticles is the interaction that exists with the cells, specifically the know the absorption mechanism of nanoparticles. Two fundamental processes when evaluating whether there are cellular cytotoxic effects caused by nanoparticles are endocytosis and exocytosis. The use of AuNEs was chosen due to the characteristics observed in chapter I. The third chapter of the project was based on the encapsidation of the nanoparticles synthesized in chapter I with the capsid of the plant virus CCMV, this to be able to use the viral capsid of the viruses as nanocontainers for the AuNPs, giving them greater biocompatibility. Durability and stability, so that they can be used in biomedical therapies. The last stage is called a study of the swelling process of the Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV) and Brome Mosaic Virus (BMV). In this stage of the project, the amplification and purification of the CCMV and BMV viruses were first carried out, subsequently, the evaluation of the changes in the diameter of the viral capsid was carried out, when exposed to different conditions of pH and ionic strength (IF), these studies arose from the question: how does the capsid protect the viral genome from the changes in pH and FI that you encounter on your way? That is to say, since the virus enters the host and reaches the cell there are different physicochemical conditions of pH and the FI, there are antecedents that have shown that viruses suffer swelling, which was previously believed to be 10% in the viral capsid, due to this increase in size, the hypothesis arises that the 5' and 3' ends of the genetic material are exposed, this would give the cellular machinery the possibility of taking the RNA and continuing with the replication. For this reason, CCMV and BMV were subjected to different pH and FI conditions, which were evaluated by DLS, MET and atomic force microscopy (AFM), where it was demonstrated that the viral capsids have a swelling greater than the 10% reported with previously in the literature.