Caracterización termodinámica del dominio-N de la H+-ATPasa de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae

Abstract

La H⁺-ATPasa de levadura es la enzima encargada de bombear protones a través de la membrana plasmática celular regulando el pH intracelular y suministrando energía para distintos procesos esenciales acoplados; por lo tanto, su correcta expresión y funcionamiento es vital. El dominio-N forma parte de la porción citoplasmica de la estructura y posee motivos conservados. Es la encargada de unir el ATP a la enzima y así dar inicio al proceso de bombeo de protones. En este proyecto se diseñó in silico y se expresó el dominio-N 100% homólogo de la H⁺-ATPasa codificada por el gen PMA1 de Saccharomyces cerevisiae de forma recombinante en células de Escherichia coli. La H⁺-ATPasa de S. cerevisiae contiene 15 residuos triptófano de los cuales solamente uno se encuentra presente en el dominio-N, el cual se usa como reportero de fluorescencia de cambios estructurales. Con experimentos en su estado nativo y curso de tiempo se evaluó la posición del residuo sobre la estructura y su distancia al sitio de unión a nucleótidos, la afinidad a nucleótidos e iones presentes en el citoplasma, y además la estabilidad termodinámica. De igual forma se realizaron experimentos donde se observa la evolución de la estructura secundaria mediante la obtención de su espectro de dicroísmo circular en distintas condiciones. Métodos de simulación computacional como docking y dinámica molecular complementaron los resultados experimentales y asi se obtuvo una descripción más detallada de los fenómenos observados. Siendo el dominio-N de la H⁺-ATPasa de S. cerevisiae el más pequeño de su tipo y conteniendo los elementos mínimos estructurales para poder ser caracterizada; se espera que los resultados puedan ser extrapolados y así generar un modelo de unión a nucleótidos para P-ATPasas más complejas. De igual forma se busca contribuir a un mejor entendimiento sobre la patogénesis de distintas enfermedades involucradas con las P-ATPasas ya que se han identificado al menos 36 tipos en humanos y diversos síndromes se les han sido asociados. Además, las P-ATPasas se han identificado como un blanco para el desarrollo de fármacos para el tratamiento del cáncer y, enfermedades por hongos (micosis) y protozoarios (malaria).