Análisis de S100A9 en viabilidad, proliferación y migración dependiente de la expresión de RB en H1299

Abstract

El Retinoblastoma es un cáncer infantil causado por una mutación en el gen RB1, que desregula la actividad de la proteína RB, la cual está implicada en el correcto funcionamiento del ciclo celular. Mutaciones en RB1 ocasionan la formación de retinomas y eventualmente, la proliferación descontrolada de células en la retina. La forma más común de detección de tumores de Retinoblastoma es mediante la presencia de un reflejo blanco en el ojo (leucocoria) y en algunos casos, el estrabismo. Esta forma de diagnóstico generalmente implica una detección tardía del cáncer y, por lo tanto, un aumento del riesgo de invasión incurable del ojo, pérdida de la vista o incluso la muerte. Nuestro grupo de investigación observó un perfil proteómico en lágrimas de pacientes diagnosticados con Retinoblastoma que se comparó con un grupo control. Después de realizar análisis bioestadísticos y bioinformáticos, se detectó un grupo de proteínas estadísticamente relevantes que presentan una sobreexpresión en lágrimas de pacientes de Retinoblastoma. Estas proteínas se consideran potenciales biomarcadores y blancos terapéuticos, además de que su estudio nos puede ayudar a comprender los mecanismos subyacentes al desarrollo de Retinoblastoma u otros tipos de cáncer. Se seleccionó S100A9 de este grupo de proteínas desreguladas, la cual se ha reportado como potencial biomarcador diagnóstico y de pronóstico en diferentes tipos de cáncer. En este trabajo se analizó el papel de S100A9 en procesos de viabilidad, proliferación y migración celular en un modelo de carcinoma pulmonar H1299 con y sin la expresión de RB. Se diseñaron y validaron oligonucleótidos para amplificación y clonación del gen humano S100A9, confirmando su correcta inserción en un plásmido recombinante y su expresión en células H1299 mediante Western Blot y qPCR. La transfección transitoria y la generación de líneas estables mostraron que la expresión de S100A9 se incrementa proporcionalmente a la cantidad de plásmido transfectado, con un efecto diferencial entre células WT y RB -/-. Los ensayos de viabilidad con tinción violeta revelaron una disminución significativa del número de colonias al aumentar los niveles de S100A9, mientras que la sobreexpresión favoreció la proliferación, confirmada por ensayos colorimétricos de resazurina. En los ensayos de migración, el aumento de S100A9 no modificó el comportamiento de células H1299 WT, pero la ausencia de RB potenció la migración celular. En conjunto, los resultados sugieren que la sobreexpresión de S100A9, junto con la pérdida de RB, podría contribuir a un fenotipo maligno caracterizado por mayor proliferación y capacidad migratoria, lo que aporta evidencia al posible rol de S100A9 como un biomarcador y modulador de la oncogénesis en retinoblastoma.

Abstract: Retinoblastoma is a pediatric cancer caused by a mutation in the RB1 gene, which leads to deregulation of the Rb protein, a key player in the proper control of the cell cycle. Mutations in RB1 result in the formation of retinomas and, eventually, the uncontrolled proliferation of retinal cells. The most common method for detecting Retinoblastoma tumors is through the appearance of a white reflex in the eye (leukocoria), and in some cases, strabismus. This method of diagnosis typically indicates a late detection of the cancer, which increases the risk of irreversible ocular invasion, vision loss, or even death. Our research group identified a proteomic profile in the tear fluid of patients diagnosed with Retinoblastoma, compared to a control group. After conducting biostatistical and bioinformatic analyses, a set of statistically significant proteins was found to be overexpressed in the tears of Retinoblastoma patients. These proteins may represent potential biomarkers and therapeutic targets, and their study may help elucidate the mechanisms underlying the development of Retinoblastoma or other types of cancer. From this group of deregulated proteins, S100A9 was selected. This calcium-binding protein has been reported as a potential diagnostic or prognostic biomarker in various cancers. This study investigated the role of S100A9 in cell viability, proliferation, and migration using the H1299 non-small cell lung carcinoma model with and without RB expression. Specific oligonucleotides were designed and validated for amplification and cloning of the human S100A9 gene, confirming its correct insertion into a recombinant plasmid and its expression in H1299 cells by Western blot and qPCR. Transient transfection and the generation of stable cell lines demonstrated that S100A9 expression increases proportionally with the amount of transfected plasmid, with differential effects between WT and RB-/- cells. Colony formation assays with crystal violet staining showed a significant decrease in viability under increasing S100A9 expression. Overexpression of S100A9 also affected cell proliferation, further confirmed by resazurin-based assays. Migration experiments revealed that increased S100A9 did not alter the behavior of H1299 WT cells but enhanced migratory capacity in RB knockout cells. Altogether, these findings suggest that S100A9 overexpression, together with RB loss, may contribute to a malignant phenotype characterized by enhanced proliferation and migration, supporting the potential role of S100A9 as a biomarker and modulator of oncogenesis in retinoblastoma.