Modificaciones estructurales y funcionales de la Ca2+-ATPasa de retículo sarcoplásmico de músculo estriado

Abstract

Durante el último siglo distintos procedimientos de purificación de proteínas han sido reportados y adaptados a proteínas y enzimas específicas. Estas metodologías usualmente no toman en cuenta a las proteínas de membrana debido a su naturaleza anfipática. De hecho, los métodos más efectivos de purificación de proteínas de membrana involucran la generación de genes sintéticos, sobreexpresión heteróloga, en algunos casos solubilización de cuerpos de inclusión y aislamiento por cromatografía. Frecuentemente, estas construcciones de genes poseen mutaciones, proteínas truncadas, etiquetas como His-tag, u otras manipulaciones que pueden cambiar la estructura nativa o modificación de la actividad, como la falta de modificaciones postraduccionales naturalmente realizadas. Por lo anterior, métodos de alto rendimiento de aislamiento para proteínas de membrana silvestres deben ser desarrolladas sin cambiar las propiedades catalíticas y conformación tridimensional de las proteínas. Como en el caso de las bombas primarias, ATPasas tipo P, muchos impedimentos dificultan la purificación de estas enzimas ya que son muy lábiles y sensibles a la temperatura. En este sentido, es bien sabido que el disacárido trehalosa modifica el entorno de la proteína previniendo inactivación catalítica y desnaturalización por interacción de puentes de hidrógeno, alta viscosidad y compactación de la estructura. Estas características previenen efectos negativos en la estructura proteica durante la purificación por muchas horas en ultracentrifugación. La purificación con trehalosa de alta eficiencia (<95%) de Ca2+-ATPasa (SERCA) de músculo de conejo y H+-ATPasa de Kluyveromyces lactis silvestres son ejemplos de la efectividad de esta metodología. Más aun, se espera que los esfuerzos para purificar otras ATPasas como Na+/K+-ATPasa, H+/K+-ATPasa, y Ca2+-ATPasa (PMCA) se logren en el futuro cercano. Notablemente, el uso de ATPasas silvestres purificadas produce estructuras e información enzimática más confiables debido a que poseen todas las modificaciones postraduccionales durante la maduración de la enzima. Finalmente, las ATPasas purificadas con trehalosa pueden ser usadas para cinética enzimática, fluorescencia, experimentos de espectro de dicroísmo circular, cristalización y determinación de estados oligoméricos. En este trabajo desarrollamos un nuevo método para aislar a la enzima SERCA de músculo de contracción rápida de conejo al adaptar nuestra metodología para H+-ATPasa de membrana plasmática de levaduras. El cual garantiza la preservación del plegamiento de proteínas por la adición de trehalosa durante la purificación por muchas horas y a alta velocidad angular. SERCA purificada mostró actividad y estructura normal de ATPasa, por ensayo acoplado de enzimas y marcado del dominio N con FITC. La cinética enzimática de ATPasa, por ensayo acoplado de enzimas, reveló una saturación hiperbólica por el ATP. Además, incrementos continuos de la concentración de ATP revelaron una saturación similar a la hiperbólica del dominio N. Tomando lo anterior, hemos desarrollado un método de aislamiento de alto rendimiento para ATPasas tipo P embebidas en membranas intracelulares usando la estabilización estructural mediada por trehalosa. En el futuro cercano este protocolo se podría usar para purificar distintas enzimas y proteínas de membrana con el fin de describir más detalladamente todas las características usando biomoléculas (enzimas o membranas) silvestres y naturalmente modificadas.

During the last century different protein purification procedures had been reported and adapted for specific proteins and enzymes. These methods usually do not take into account membrane proteins owing its amphipathic nature. In fact, the most effective membrane protein purification methods involve synthetic genes, heterologous over expression, in some cases inclusion bodies solubilization, and chromatographic isolation. Frequently, these gene constructions possess mutations, protein truncations, labels as His-tag, or other manipulations that may disrupt the native structure or modify the activity, as lack of natural-occurring post-translational modifications. Due to above, high performance isolation methods for native membrane proteins must be developed without changing their catalytic properties and protein three-dimensional conformation. As in the case of the primary active pumps, the P-type ATPases, several impediments make difficult their purification since they are very labile and sensitive to temperature. In this sense, it is well known that the disaccharide trehalose modifies the protein’s environment preventing its catalytic inactivation and denaturation by hydrogen bonds, high viscosity and structural compaction. These features prevent negative effects on the protein structure during insulation by ultracentrifugation during several hours. The high efficiency trehalose-mediated purification (>95%) of wild-types Ca2+-ATPase (SERCA) from rabbit muscle and H+-ATPase from Kluyveromyces lactis are examples of the effectiveness of this methodology. Furthermore, it is expected that the efforts for purify other ATPases as well as Na+/K+-ATPase, H+/K+-ATPase and Ca2+-ATPase (PMCA) will be reached in the near future. Notably, the usage of purified wild-type ATPases yield more reliable structural and enzymatic data due that they possess all the post-translational modifications during enzyme maturation. Finally, purified ATPases with trehalose can be used for enzyme kinetics, fluorescence, CD spectra, crystallization, and oligomeric states determination. In this work we developed a new method for SERCA isolation from fast twitch muscle from rabbit by adapting our methodology for plasma membrane H+-ATPase from yeasts. Which, guarantee protein folding preservation by the addition of trehalose during purification at high angular velocity for several hours. Purified SERCA displayed normal ATPase activity and structure by enzymes-coupled assay and FITC-labeling N domain. Enzyme kinetics revealed a hyperbolic ATP saturation. In addition, step-wise ATP increasing concentration revealed N-Domain hyperbolic-like saturation. Taking together, we have developed a high yield isolation method for P-type ATPases embedded in intracellular membranes using trehalose-mediated structural-stabilization. In the near future this protocol might be used to purify diverse membrane enzymes and proteins in order to describe more precisely all their features using wild-type and natural modified biomolecules.