Producción de candidatos vacunales contra SARS-CoV-2 en un biorreactor de tanque agitado

Abstract

La proteína recombinante LTB-p50 previamente expresada en E. coli es un candidato vacunal contra el SARS-CoV-2 que ha tenido importantes resultados. Sin embargo, la tendencia a formar cuerpos de inclusión de este sistema de expresión es contraproducente. En este estudio fue evaluada la expresión de la proteína LTB-p50 en el sistema de expresión de la levadura Pichia pastoris X33 con el objetivo de obtener la proteína soluble y secretada al medio. Tres cepas modificadas fueron obtenidas con el vector de expresión pPICZα–LTB-p50, cuya expresión en matraz evidenció cuál tuvo mejor respuesta en la expresión extracelular de la proteína recombinante. La cepa seleccionada fue cultivada en un biorreactor, evaluado dos estrategias para la expresión de la proteína. Cinco ensayos experimentales fueron desarrollados a escala de 1.2 L de volumen efectivo. Los resultados mostraron poca presencia de la proteína recombinante en el sobrenadante. Los ensayos de Dot Blot reportaron bajas concentraciones de la proteína principalmente expresada de manera intracelular. Los Western Blot desarrollados fueron negativos en todos los casos. La fermentación fue establecida a 30 °C, con 30% de concentración de oxígeno disuelto y agitación entre 500-1000 rpm. El sistema no fue capaz de garantizar la concentración de OD requerida. Finalmente, la estrategia de inducción incluyó la etapa de adaptación a metanol que debe ser optimizada.

The LTB-p50 recombinant protein previously expressed in E. coli is a vaccine candidate against SARS-CoV-2 that has had important results. However, the tendency of this expression system to form inclusion bodies is counterproductive. In this study, the expression of the LTB-p50 protein was evaluated in the expression system of the yeast Pichia pastoris X33 with the objective of obtaining the soluble protein secreted into the medium. Three strains modified with the pPICZα–LTB-p50 expression vector were obtained, whose expression in flasks showed which had the best response in the extracellular expression of the recombinant protein. The selected strain was brought to bioreactor format and two strategies for protein expression were evaluated. Five experimental runs were developed at a scale of 1.2 L of effective volume. The results showed incipient presence of the recombinant protein in the supernatant. Dot Blot assays reported low concentrations of the protein mainly expressed intracellularly. The Western Blot developed was negative in all cases. Fermentation was established at 30 °C, 30% dissolved oxygen concentration and stirring between 500 -1000 rpm. The system was not able to guarantee the required OD concentration. Finally, the induction strategy included the adaptation stage to methanol, which must be optimized.