Establecimiento de las condiciones para el análisis de expresión diferencial de la interacción Typha latifolia-Pseudomonas rhodesiae

Abstract

Se ha demostrado que la inoculación de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR) en plantas acumuladoras de metales pesados incrementa la eficiencia de la fitorremediación. Pseudomonas rhodesiae GRC140 es considerada una PGPR debido a la producción de sideróforos, ácido indolacético, ACC-desaminasa y solubilización de fosfatos. Por su parte, Typha latifolia es una de las plantas más utilizadas en fitorremediación por su capacidad para tolerar y remover metales pesados, pero la mayoría de los estudios se han enfocado en las capacidades de remoción de Cd en humedales artificiales, in situ e in vitro, por lo que se desconocen los mecanismos moleculares en respuesta al estrés por Cd. Los estudios genómicos permiten explicar los mecanismos implícitos y pueden aprovecharse para lograr una mayor fitorremediación. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue estandarizar las condiciones de la interacción de T. latifolia-P. rhodesiae GRC140 para el análisis de RNAseq. Inicialmente, se realizó un ensayo de germinación en el que se determinó la tasa de germinación y se evaluó la longitud y el peso fresco y seco de brotes y raíces. Posteriormente, se estableció el cultivo in vitro de T. latifolia en sistemas de hidroponía y se siguió un diseño experimental donde las plántulas estuvieron expuestas 10 días a distintos tratamientos con P. rhodesiae GRC140 y 40 mg/L Cd. Al finalizar la exposición, se realizó un análisis fenotípico, se estudió el comportamiento del pH en el medio hidropónico, se determinó el contenido de glutatión total, el porcentaje de fuga de electrolitos, se cuantificaron los niveles de Cd mediante EAA, se aisló el ARN total vegetal y se determinó la expresión de los genes de metalotioneína, fitoquelatina sintasa, CL7951, CL354, CL3870 y Unigene11164 por RTqPCR. Los resultados mostraron que P. rhodesiae GRC140 induce el desarrollo temprano de T. latifolia y mejora el porcentaje de germinación en semillas expuestas a Cd, además, promueve el crecimiento vegetal en plántulas de 15 días de crecimiento. En condiciones hidropónicas, P. rhodesiae GRC140 promueve el desarrollo de pelos radiculares en T. latifolia. Se incrementó la fuga de electrolitos y el contenido de GSH en el tejido radicular de plántulas expuestas a Cd, mientras que P. rhodesiae GRC140 minimizó el contenido de GSH hasta niveles basales. P. rhodesiae GRC140 mejoró el contenido de Cd en brotes y raíces de T. latifolia, el BCF y el BAC. Los genes de metalotioneína, CL7951, CL354, CL3870 y Unigene11164 se encontraron reprimidos en T. latifolia expuesta a Cd, mientras que P. rhodesiae GRC140 indujo la expresión del gen CL3870, después de 10 días deVI interacción. Los resultados de este trabajo son la base para realizar análisis de expresión y genómica funcional de la interacción de T. latifolia-P. rhodesiae GRC140 y tratar de desarrollar estrategias eficientes en la fitoextracción de Cd por T. latifolia.

Plant Grow Promoting Rhizobacteria (PGPR) inoculation has been shown to increase heavy metal accumulation and then phytoremediation efficiency. Pseudomonas rhodesiae GRC140 is considered a PGPR due to the production of siderophores, indoleacetic acid, ACCdeaminase, and phosphate solubilization. Typha latifolia is one of the plants most used in phytoremediation due to its ability to tolerate and remove heavy metals. Most studies have focused on the Cd removal capacities in artificial wetlands, in situ and in vitro. However, the molecular mechanisms involved in response to Cd stress or in its interaction with PGPR during phytoremediation processes remain unknown. Genomic studies allow the implicit mechanisms to be explained and these can be used to achieve greater phytoremediation. Therefore, the aim of this work was to standardize the conditions of T. latifolia-P. rhodesiae GRC140 interaction to perform RNAseq analysis. Initially, germination tests were carried out to determine germination rate, the root length, and fresh and dry weight of shoots. Besides, T. latifolia in vitro cultures were established in hydroponic systems and the seedlings were exposed to P. rhodesiae GRC140, 40 mg/L Cd, or both for 10 days. Phenotypic analysis, pH of the hydroponic medium, total glutathione, electrolyte leakage percentage, and Cd quantitation by EAA were determined. Total RNA of treated plants was isolated and the expression of metallothionein, phytochelatin synthase, CL7951, CL354, CL3870 and Unigene11164 genes were determined by RT-qPCR. The results showed that P. rhodesiae GRC140 induces the early development of T. latifolia and improves the germination percentage in seeds exposed to Cd. In addition, bacterium promotes plant growth in 15-day-old seedlings. Under hydroponic conditions, P. rhodesiae GRC140 promotes root hair development in T. latifolia. Electrolyte leakage and GSH content were increased in the root tissue of seedlings exposed to Cd, while P. rhodesiae GRC140 decreased GSH content to basal levels. P. rhodesiae GRC140 improved the Cd content in shoots and roots, the BCF and the BAC of T. latifolia exposed to Cd. Metallothionein, CL7951, CL354, CL3870 and Unigene11164 were downregulated in T. latifolia exposed to Cd, while P. rhodesiae GRC140 upregulated CL3870 gene, after 10 days of interaction. The results of this work are the basis to carry out functional genomics analyzes of the T. latifolia-P. rhodesiae GRC140 interaction and try to develop efficient strategies in the phytoextraction of Cd by T. latifolia.