Análisis de la frecuencia y actividad de células reguladoras Breg, Treg17 y Th1-IL-10 en pacientes con Diabetes Mellitus tipo 2 e individuos control

Abstract

Introducción. En el proceso de patogénesis de la DM2 se observa una respuesta inmune con fenotipo proinflamatorio con el aumento de células T efectoras Th17 y Th1 que provocan un incremento de citocinas proinflamatorias como IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-17 e IFN-γ. Estas citocinas al promover la resistencia a la insulina y la disfunción y destrucción de las células beta pancreáticas, contribuyen al desarrollo y la progresión de la enfermedad. Algunas subpoblaciones de células reguladoras como las Treg17 (CD4+FOXP3+IL-17+), las células Breg CD19+Foxp3+, CD19+CD39+, CD19+Foxp3+CD39+ y las células Th1 productoras de IL-10 (CD4+IFN-γ+IL-10+) modulan e inhiben la actividad de las células efectoras Th1 y Th17 a través de diferentes mecanismos supresores. Objetivo. Determinar la frecuencia de células CD4+Foxp3+IL-17+, CD4+Foxp3+ CD4+IL-17+, CD4+IFN-y+, CD4+IL-10+, CD4+IL-10+INF-y+ y células Breg CD19+FOXP3+, CD19+CD39+, CD19+CD39+Foxp3+ en pacientes con DM2 e individuos control, así como su relación con parámetros antropométricos, de resistencia a la insulina, funcionalidad de las células beta pancreáticas, control glucémico e inflamación. Métodos. Se reclutaron 30 participantes, incluidos 15 individuos sanos (grupo de control) y 15 pacientes con DM2. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron a partir de una muestra de sangre mediante centrifugación utilizando el gradiente Ficoll-Histopaque. Posteriormente, para evaluar los fenotipos de células CD4 + una parte de las PBMC purificadas fueron cultivadas y estimuladas con perlas acopladas con anti-CD3/anti-CD28 y se tiñieron con anticuerpos monoclonales específicos para los antígenos CD4, Foxp3, IL-17, IL-10, IFN- conjugados con fluorocromos. Para la identificación de los fenotipos de Breg otra parte de las PBMC purificadas fueron teñidas con anticuerpos para CD19, CD39 y Foxp3 conjugados con flourocromos. Las muestras se adquirieron en una FACSCanto II. El porcentaje de células positivas se determinó con el software FACS-Diva (BD Biosciences). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Kruskal-Wallis y el análisis univariable de correlación de Spearman. Se consideró un valor de (P< 0,05) como significativos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software de GraphPad Prism 8.0, San Diego, Calif. EE.UU. Resultados. Se observó un incremento en la frecuencia de células CD4+ IL17+, CD4+Foxp3+IL-17+ y CD4+IFN-γ+ en pacientes con DM2 en comparación con individuos control. Los porcentajes de células CD4+IL-10+ y CD4+IFN-γ+IL-10+ fueron similares entre ambos grupos. Por otro lado, se observó una disminución en los porcentajes de células CD19+Foxp3+ y CD19+CD39+Foxp3+ en pacientes con DM2 en comparación a los sujetos control. Se encontró una asociación entre los niveles de células CD4+Foxp3+IL-17-, CD4+ Foxp3-IL-17+, CD4+IL-17+Foxp3+ y el IMC (Índice de masa corporal) y el ICC (Índice cintura-cadera) en pacientes con DM2. Las células CD4+IL-10+ se asociaron también con el IMC en pacientes con DM2. En el grupo control, los porcentajes de células CD4+IFN-γ + y CD4+IFN-γ+IL-10+ se asociaron con niveles de triglicéridos en sangre y el ICC respectivamente. Los niveles de células CD19+Foxp3+CD39- se asociaron con niveles de colesterol total y colesterol LDL. Conclusión. Existe una alteración en las células T CD4+ activadas de pacientes con DM2 que consistió en un incremento del número de células CD4+IL-17+, CD4+IFN-γ+ y CD4+Foxp3+IL-17+, y una disminución de células reguladoras; CD4+Foxp3+, CD19+Foxp3+ y CD19+CD39+Foxp3+.Esta alteración es consecuencia de factores como la obesidad, adiposidad abdominal y los niveles de lípidos. Dada la importancia de las células Th17 y Th1 en la promoción de la inflamación y las complicaciones en la DM2, los resultados de este estudio pueden sentar bases para la búsqueda de estrategias dirigidas a la regulación de células del sistema inmune, lo que permitirá la supresión de la inflamación en pacientes con DM2.

Introduction. The pathogenesis of type 2 diabetes (TDM2) has been associated with the immune response, suggesting that patients with T2DM may benefit from suppression of inflammation. T2DM is characterized by showing a bias of the immune response towards a proinflammatory phenotype due to the increase in Th17 and Th1 effector T cells that cause an increase in the systemic level of proinflammatory cytokines such as IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-17 and IFN-γ. This promotes? insulin resistance and pancreatic beta cell dysfunction and destruction, contributing to the development and progression of the disease. Some regulatory cell subtypes such as Treg17 (CD4+FOXP3+IL-17+), Foxp3+CD39+ B cells and IL-10 producing Th1 cells (IL-10-Th1+) modulate and inhibit the activity of Th1 and Th17 effector cells through different suppressive mechanisms. Objective. To determine the frequency of CD4+Foxp3+IL-17+, CD4+Foxp3+ CD4+IL-17+, CD4+IFN-y+, CD4+IL-10+, CD4+IL-10+INF-y+ and Breg CD19+FOXP3+, CD19+CD39+, CD19+CD39+Foxp3+ cells in patients with DM2 and control individuals, as well as their relationship with anthropometric parameters, insulin resistance, pancreatic beta-cell functionality, glycemic control and inflammation Methods. Fifteen patients with DM2 and 15 healthy individuals (control group) were included. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from a blood sample by centrifugation using the Ficoll-Histopaque gradient. Subsequently, the purified PBMC were cultured and stimulated with CD3/CD28 activation beads and immunostained with monoclonal antibodies. The percentage of positive cells was determined by flow cytometry using a FACS canto II. Statistical analysis was performed by Kruskal-Wallis test (P < 0.05) and correlation between anthropometric, biochemical measures and cell percentages were calculated by univariate spearman correlation analysis using GraphPad Prism 8.0 software, San Diego, Calif. USA) 2 Results. An increased frequency of CD4+IL17+, CD4+Foxp3+IL-17+ and CD4+IFN-γ+ cells was observed in patients with DM2 compared to control individuals. The percentages of CD4+ IL-10+ and CD4+IFN-γ+IL-10+ cells were similar between both groups. On the other hand, the percentages of CD19+Foxp3+ and CD19+CD39+Foxp3+ cells were found decreased in patients with DM2. Statistical analysis revealed that the levels of CD4+Foxp3+, CD4+ IL-17+, CD4+IL-17+Foxp3+ cells were associated with BMI and CHF in patients with DM2. CD4+IL0+ and CD4+IFN-γ+ cells were also associated with BMI in patients with DM2. In the control group we found an association of CD4+IFN-γ + and CD4+IFN- γ+ IL-10+ cells with blood triglyceride levels and CHF respectively. CD19+Foxp3+ cells were associated with total cholesterol and LDL-cholesterol levels. Finally, the percentages of CD19+CD39+Foxp3+ cells were associated with CHF in this group. Conclusion. In this study it was demonstrated that there is an alteration in activated CD4+ T cells of patients with DM2 that consisted of an increase in the number of CD4+IL-17+, CD4+IFN-γ+ and CD4+Foxp3+IL-17+ cells, and a decrease in regulatory cells; CD4+Foxp3+, CD19+Foxp3+ and CD19+CD39+Foxp3+. This alteration seems to be a consequence of factors that accompany DM2 such as obesity, abdominal obesity and alterations in lipid levels. Given the importance of Th17 and Th1 cells in the promotion of inflammation and complications in DM2, the results of this study may lay the groundwork for the search for strategies aimed at the regulation of immune system cells, specifically Th17 and Th1, which will allow the suppression of inflammation in patients with DM2.