Estudio de un inmunoensayo de flujo lateral para la detección de SARS-CoV-2 utilizando nanopartículas de oro como reporteros visuales

Abstract

Este trabajo estableció una metodología para la evaluación y optimización de las condiciones de un inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, lateral flow immunoassay) con nanopartículas de oro (AuNP) como agentes reporteros, usando sistemas modelos a fin de desarrollar un LFIA para la detección de partículas similares a la estructura del SARS-CoV-2. Evaluamos la detección de partículas tipo virus (VLP, virus-like particles) y pseudovirus que presentan en su superficie proteínas multiméricas de SARS-CoV-2. Ambas son similares al virus nativo, pero carecen de genoma viral. Para esto utilizamos conjugados de AuNP con antisueros complejos conteniendo anticuerpos (anti-P6) afines a un epítopo de la región del dominio de unión del receptor (RBD, receptor-binding domain) de la proteína espícula y anticuerpos (anti-P50) que reconocen epítopos de la región conservada de la proteína espícula. La respuesta del inmunoensayo aumentó al emplear como agente de bloqueo 1 % de leche y dejando secar la membrana durante 24 h para disminuir respuestas no específicas en ensayos de flujo lateral. Como condiciones de operación fueron establecidas 15 μL de conjugado concentrado 5×, conteniendo 0.05 % de polisorbato y dejando en contacto 15 min. La aparición de un punto rojo intenso fue indicativa de pruebas positivas. La membrana solo dio resultados positivos con los analitos de interés y no hay respuesta cruzada con otras muestras probadas. Podría usarse como un método confiable en el monitoreo y control de COVID-19. Las pruebas existentes son adquiridas actualmente de otros países. Este proyecto contribuye al desarrollo de esta tecnología en el país y permitió establecer precedentes para continuar con el desarrollo de este tipo de pruebas de diagnóstico, que son necesarias en el mundo en desarrollo. Son una de las alternativas más prácticas para el diagnóstico de enfermedades.

This work established a methodology for the evaluation and optimization of the conditions of a lateral flow immunoassay (LFIA) with gold nanoparticles as reporter agents, using model systems to develop an LFIA for the detection of SARS-CoV-2. We evaluated the detection of virus-like particles (VLPs) and pseudoviruses that present SARS-CoV-2 multimeric proteins on their surface of. Both are similar to the native virus but lack the viral genome. For this, AuNPs conjugates were prepared with complex antiserum containing antibodies (anti-P6) related to an epitope of the receptor-binding domain (RBD) region of the spike protein and antibodies (anti-P50) that recognize epitopes from the conserved region of the spike protein. The immunoassay response is increased by using 1 % milk as a blocking agent and allowing the membrane to dry for 24 h to decrease non-specific responses in lateral flow assays. As operating conditions, 15 μL of 5× concentrated conjugates were established, with 0.05% polysorbate and a contacting time of 15 min. The appearance of a deep red dot was indicative of positive tests. The membrane tested positive only with the analytes of interest and there was no cross-response with other samples tested. The test developed above could be used as a reliable method in the monitoring and control of COVID-19. Existing tests are currently purchased from other countries. This project contributes to the development of this technology in the country and allows to establish precedents to continue with the development of this type of diagnostic tests, which are necessary in the developing world. They are one of the most practical alternatives for the diagnosis of diseases.