Papel de los receptores purinérgicos p2x7 y p2y2 en el procesamiento de app en neuronas en cultivo expuestas a arsénico

Abstract

El arsénico (As) es un metaloide tóxico que afecta al sistema nervioso central (SNC), la exposición crónica a este agente neurotóxico induce alteraciones bioquímicas, patológicas y clínicas similares a las presentadas en la Enfermedad de Alzheimer (EA), por ejemplo, la hiperfosforilación de la proteína tau y la sobretranscripción de la proteína precursora amiloide (APP), representando un probable factor de riesgo para el desarrollo de esta patología (Alarcón et al., 2014; Carroll et al., 2017; Gong & OʼBryant, 2010; Y. Li et al., 2017; Ríos et al., 2012). APP es procesada a través de dos vías en el SNC, la vía amiloidogénica y no amiloidogénica. La primera es mediada por la enzima β-secretasa favoreciendo la generación de péptidos -amiloide (A), mientras que en la vía no amiloidogénica participa α-secretasa, una enzima que previene la generación de A, el principal componente de las placas seniles características de la EA (Bhadbhade & Cheng, 2012; Van der Kant & Goldstein, 2015). Se ha demostrado que los receptores purinérgicos P2X7 y P2Y2 modulan la actividad de α-secretasa, la estimulación de P2X7 la inhibe, mientras que la de P2Y2 la activa (Erb et al., 2018; León-Otegui et al., 2011; Miras-Portugal et al., 2015). Resultados de nuestro grupo han demostrado tanto en un modelo in vivo como in vitro que la exposición a As incrementa la expresión de P2X7 y disminuye P2Y2, así mismo, la actividad de α-secretasa disminuye. También se demostró que la exposición a As incrementa la producción de Aβ y la actividad de la enzima β-secretasa manera significativa en tejido cerebral de rata (Nino et al., 2018). Por lo anterior el presente proyecto tuvo como objetivo determinar si la actividad de α y β-secretasas son dependientes de la señalización purinérgica en un modelo in vitro expuesto a As, además de elucidar si el As altera la expresión a nivel de mRNA de estos receptores. Para cumplir con ello, células N2a fueron expuestas a 10M arsenito de sodio y 7.5M DMAV por 24h, se realizaron extracciones de RNA para medir la expresión de los receptores a nivel de mRNA por RT-qPCR. Además, las células fueron estimuladas con BzATP en presencia y ausencia de inhibidores de P2X7, obteniéndose lisados celulares para la medir la actividad de α y β-secretasas por ELISA. Como resultados se logró estandarizar las condiciones de cultivo e intoxicación y las condiciones de

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amplificación de los oligonucleótidos diseñados para P2X7 y P2Y2 por PCR punto final, donde se observó una disminución de P2Y2 y un aumento de P2X7 mismo que fue corroborado por RT-qPCR. Además, se encontró que la activación del receptor P2X7 inhibe la actividad de α-secretasa y media el aumento de la actividad de β-secretasa. Por tanto, se concluye que la exposición neuronal a As afecta la modulación de α y βsecretasas a través de la alteración en la expresión de los receptores purinérgicos P2X7 y P2Y2, lo que posiblemente contribuye de manera similar con la neurodegeneración de la EA.

Arsenic is a toxic metalloid that affects the central nervous system (CNS). Chronic exposure to this neurotoxic agent has been reported to induce biochemical, pathological, and clinical alterations similar to those caused by Alzheimer’s Disease (EA), for example, the hyperphosphorylation of the tau protein and the overtranscription of the amyloid precursor protein (APP), representing a probable risk factor for the development of this pathology. APP is a transmembrane protein which is processed through two different pathways in the CNS: the amyloidogenic and non amyloidogenic. In the amyloidogenic pathway, the β-secretase enzyme induces the production of -amiloide peptides (A), the main component of senile plaques characteristic of EA. The non-amyloidogenic, there is the participation of α-secretase, an enzyme that inhibits the generation of Aβ. It has been shown that the purinergic receptors P2X7 and P2Y2 regulate the activity of α-secretase, P2X7 stimulation inhibits it, while P2Y2 stimulation activates it. Results of our group have shown in an in vivo and in vitro model that exposure to As increases the expression of P2X7 and decreases P2Y2, likewise, the activity of α-secretase decreases. As far as we know, there is no study evaluating the activity of these receptors in relation to As. Besides the mechanism for which As could be altering the expression of these receptors is not defined. Therefore, the main objective of the present work was to determine if the activity of α and β-secretases are dependent on purinergic signaling in an in vitro model exposed to As, in addition to elucidating whether As alters the expression at the mRNA level of purinergic receptors.