Generación de construcciones para la transformación genética de Chlamydomonas reinhardtii y Escherichia coli para la expresión de enterocina AS-48

Abstract

La transmisión de patógenos mediante los alimentos es un problema mundial de salud pública; una alternativa para mantener la inocuidad alimentaria es el uso de péptidos antimicrobianos (PAMs), de los cuales, el más utilizado es la Nisina; sin embargo, al tener restricciones en su uso debido sus propias características, resulta importante la búsqueda de nuevas opciones que puedan ser ampliamente utilizadas. La Enterocina AS-48, un PAM producido en Enterococcus faecalis, presenta un amplio espectro de inhibición frente a bacterias de interés en la industria alimenticia comoStaphylococcus aureus y Listeria monocytogenes; sin embargo, al ser E. faecalis un patógeno humano, se manifiesta la necesidad de contar con plataformas de expresión que sean seguras para el ser humano. Por lo anterior, en el presente trabajo se han desarrollado las construcciones pET32-AS48 y p463AS48 que permiten la expresión de la Enterocina AS-48 en la cepa BL21pLysS deEscherichia coliy en el cloroplasto deChlamydomonas reinhardtii,respectivamente. La construcción pET32-AS48 fue introducida en células calcio competentes de E. coli BL21pLysS mediante choque térmico, y tras confirmar la transformación y orientación del gen mediante PCR, se realizó la inducción de la expresión de la Enterocina AS-48 utilizando IPTG como inductor; identificando el péptido recombinante mediante ELISA indirecta. Los resultados muestran que el péptido transgénico se expresa mayormente en la fracción proteica insoluble,con las condiciones de incubación a 28°C, 1mM de IPTG y 6 horas después de la inducción. Por otra parte, la construcción p463-AS48 se insertó en el genoma del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii mediante balística y el cultivo se mantuvo en medio selectivo para evitar la pérdida del transgén. A la fecha se cuentan con colonias de microalgas creciendo en medio selectivo. Con los resultados preliminares obtenidos se sientan las bases para la producción a gran escala de la Enterocina AS-48 y su posteriorutilización dentro de la industria alimenticia.

Food spoilage bacteria transmission is a global public health problem; an alternative to maintain food safety is the use of antimicrobial peptides (AMPs), of which the most used is Nisin; however, since its use is restricted due to its own characteristics, the search of new options that can be widely used is very important. Enterocin AS-48, an AMP produced in Enterococcus faecalis, has a broad spectrum of inhibition against bacteria of interest in the food industry such as Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes; however, since E. faecalis is a human pathogen, there is a need for having a platform expression safe for humans. Therefore, in the present work we developed the pET32-AS48 and p463-AS48 constructs that allow the expression of Enterocin AS-48 in the strain BL21pLysS of Escherichia coli and in the chloroplast ofChlamydomonas reinhardtii,respectively. The pET32-AS48 construct was introduced into calcium competentE. coliBL21pLysS cells by heat shock, and after confirming the transformation and orientation of the gene by PCR, the expression of Enterocin AS-48 was induced using IPTG; identifying the recombinant peptide by indirect ELISA. The results show that the transgenic peptide is mostly expressed in the insoluble protein fraction, with the incubation conditions at 28 ° C, 1mM IPTG and 6 hours postinduction. On the other hand, the p463-AS48 construct was inserted into the chloroplast genome of Chlamydomonas reinhardtii by biolistic. At present, we have colonies growing in selective medium. The preliminary results obtained, lay the foundations for the large-scale production of Enterocin AS-48 and its subsequent use within the food industry.