Análisis cinético de los canales de cloruro activados por calcio

Abstract

TMEM16A (ANO1) y TMEM16B (ANO2) son unidades estructurales de los canales de cloruro activados por calcio (CaCCs). El movimiento del ion cloruro (Cl-) a través de TMEM16A desempeña un papel importante en varias funciones celulares tales como: la regulación de la contracción de músculos suaves, regulación de la excitabilidad cardiaca y neuronal, secreción de saliva, influencia en el crecimiento y proliferación de tumores en muchos tipos de cáncer. Se sabe que el mecanismo de apertura y cierre de TMEM16A es regulado por la combinación de factores como son cambios en el voltaje de membrana positivos (Vm), cambios en la concentración de calcio del medio intracelular ([Ca2+]i) y cambios en la concentración de cloruro del medio extracelular ([Cl-]e). Para poder entender el mecanismo de apertura y cierre de TMEM16A, en este trabajo se realizó un análisis de la cinética de la corriente de cloruro (ICl) generada por TMEM16A cuando se expresó en células HEK293. Esto permitió a su vez construir modelos de Estados Discretos de Markov para describir y entender el mecanismo de apertura y cierre de TMEM16A debido al acoplamiento de Vm, [Ca2+]i y [Cl-]e. De los distintos modelos probados, un modelo de 12 estados reprodujo exitosamente las propiedades de activación de TMEM16A. Nuestro modelo establece que para activarse, TMEM16A requiere de la unión directa, secuencial y modulada por el Vm de dos iones de Ca2+ del medio intracelular. Por otra parte, el papel del Cl- extracelular sobre el mecanismo de apertura de TMEM16A es el de favorecer la configuración abierta que el canal logra por la unión del Ca2+ y la acción del Vm. Interesantes predicciones emanan del modelo de 12 estados; (1) el Cl- extracelular no cambia la sensibilidad por Ca2+ del canal, esto fue corroborado experimentalmente, y que más bien el papel del Cl- extracelular estabiliza la apertura del canal lograda por Ca2+, (2) sugiere una participación directa del ion Cl- como responsable de propiciar la activación dependiente del voltaje del canal.

TMEM16A (ANO1) and TMEM16B (ANO2) are structural components of calcium-activated chloride channels. Cl- movement through TMEM16A regulates several physiological and pathophysiological processes such as smooth muscle contraction, cardiac and neuronal excitability, salivary secretion, tumour growth and cancer progression. Gating of TMEM16A is complex because involves the interplay between increases in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i), membrane depolarization, extracellular Cl- or permeant anions. Our goal here was to understand how these variables regulate TMEM16A gating. For this purpose we developed different discrete states Markov models. We found that a 12-states Markov model explains correctly TMEM16A activation properties caused by the coupling of changes on voltage membrane (Vm), [Ca2+]i and [Cl-]e. The 12-states model stablishes that TMEM16A activation is achieved by as a sequential, direct and Vm-dependent binding of two Ca2+ ions coupled to a Vm-dependent binding of an external Cl- ion, with Vm-dependent transitions between states. Interestingly our model predicts that (1) extracellular Cl- does not alter the apparent Ca2+ affinity of TMEM16A, which was experimentally corroborated, instead extracellular Cl- acts by stabilizing the open configuration induced by Ca2+ and (2) Cl- ions contribute to the Vm dependence of activation.