Utilización de proteinas de fusión en el estudio de la localización subcelular de la GTPasa Parcs/Gpn3

Abstract

La ARN polimerasa II (ARNP II), un complejo enzimático de 12 subunidades polipeptídicas, se encarga de transcribir los genes que codifican para proteínas en el núcleo de las células eucariontes; sin embargo, el mecanismo mediante el cual la ARNP II es transportada al interior del núcleo en células de mamífero, aún es desconocido. Recientemente se demostró que Parcs/Gpn3, una pequeña GTPasa de la familia de proteínas GPN, es requerida para la acumulación nuclear de la ARN polimerasa II [8]. En el presente trabajo, se consideró la posibilidad de que Parcs/Gpn3 pudiese estar involucrada de forma directa en la importación nuclear de la ARNP II y se buscó identificar una señal de localización nuclear (NLS) funcional en Parcs/Gpn3 de Homo sapiens, hGpn3. Para tal efecto, se analizó la secuencia primaria de la proteína por inspección visual y, mediante servidores de predicción, se encontraron cuatro regiones de aminoácidos que se ajustan a NLS consenso; las cuales se introdujeron en el sitio de clonación múltiple del vector ptetraEGFP. Las construcciones moleculares resultantes se transfectaron en células HEK 293T/17 y su localización subcelular fue determinada por medio de microscopía de fluorescencia. Dos secuencias monopartitas y una bipartita en hGpn3 fueron suficientes para dirigir el transporte nuclear de la proteína reportera tetraEGFP al núcleo de las células. Por otro lado, mutaciones puntuales en los residuos básicos que conforman a estas tres posibles señales de localización nuclear en el contexto del polipéptido híbrido hGpn3-EYFP no tuvieron ningún efecto sobre su distribución. La perturbación de la vía de transporte activo entre el núcleo y el citoplasma mediante una versión mutante dominante negativa de Ran, RanQ69L, que es incapaz de hidrolizar GTP y que además inhibe el funcionamiento de la proteína endógena, sugirió que hGpn3-EYFP se localiza en el núcleo pero no lo hace por transporte activo. De forma paralela, se observó que la co-transfección de hGpn3-EYFP y mXab1/Gpn1 ocasiona la acumulación citosólica de la primera y se planteó la posibilidad de que Gpn1 lleve acabo alguna función intracelular que promueva la retención citoplásmica de hGpn3-EYFP, la cual se ve sobrepasada por niveles altos en la expresión del polipéptido híbrido generados por la transfección transitoria. Con el fin de constatar esta idea, se desarrolló una línea celular que expresa establemente a hGpn3-EYFP; en este sistema, la proteína se encuentra exclusivamente en el citoplasma y parece presentar una distribución localizada, como agregados perinucleares. La semejanza de este arreglo con el de otras proteínas que están involucradas en la vía secretoria como !-COP, adaptina " y ERGIC 53, abre una nueva interrogante en cuanto a la posible participación de hGpn3 en esta ruta. Durante el desarrollo de este proyecto, se examinaron algunos escenarios plausibles que contemplan esta probabilidad; se realizaron diversos tratamientos con fármacos dirigidos y se desarrolló una nueva línea celular que expresa establemente a la proteína hGpn3-Ha, con el fin de contrastar la localización subcelular del polipéptido híbrido hGpn3-EYFP con aquella de una proteína que posee un marcador molecular más pequeño, como es el caso de Ha, y niveles de expresión más parecidos a los del polipéptido endógeno.