Analysis of pathogenic variants in retinoblastoma

Abstract

Antecedentes. La proteína RB codificada por el gen RB1, es un supresor tumoral que regula el ciclo celular. Las mutaciones en RB1 se asocian con diversos tipos de cáncer, de hecho, fue el primer gen supresor tumoral relacionado con el desarrollo de retinoblastoma. Este tipo de cáncer es una neoplasia maligna ocular pediátrica que se origina en la retina. En 1971 Knudson propuso la hipótesis de los dos golpes, la cual establece que se requieren dos eventos mutacionales para iniciar la progresión tumoral, ya sea de manera esporádica o hereditaria. Objetivo Caracterizar las mutaciones puntuales del gen RB1 asociadas con el retinoblastoma, contribuyendo así a la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la enfermedad. Métodos. Se analizaron cuatro mutaciones puntuales en el gen RB1 asociadas con retinoblastoma: una mutación sinónima (pA14A), dos mutaciones con cambio de sentido (pN328H y pD718N) y una mutación con codón de terminación prematuro (R552*), con el objetivo de caracterizar sus efectos celulares y moleculares. Se evaluaron los niveles de expresión de ARNm y proteína, así como la proliferación, viabilidad, localización subcelular y migración celular utilizando una línea celular RBKO. Resultados. Todas las mutantes se expresaron tanto a nivel de ARNm como de proteína. En cuanto a la localización subcelular la mutante pN328H se restringió al núcleo, mientras que pA14A, pR552* y pD718N se localizaron tanto en el núcleo como en el citoplasma. Los ensayos comparativos de viabilidad, proliferación y migración entre todas las variantes y la proteína RB de tipo silvestre mostraron alteraciones significativas, particularmente la mutante pR552*, la cual presento cambios mas notorios. Se generó una construcción de pR552* sin la etiqueta HA y tras su transfección estable, se confirmó que los efectos observados no dependían de dicha etiqueta. De manera destacada, la coexpresion de pR552* y RB silvestre demostró que la mutante pR552* por si sola es suficiente para mantener el fenotipo mutante. Conclusiones. Nuestros resultados sugieren que la mutante pR552* presenta características de ganancia de función, ya que no solo pierde su función supresora característica, sino que además adquiere propiedades que alteran el comportamiento celular.

Background. The RB protein encoded by the RB1 gene is a tumor suppressor that regulates the cell cycle. Mutations in RB1 are associated with several types of cancer; indeed, it was named after the first tumor suppressor linked to the development of retinoblastoma. This type of cancer is a pediatric ocular malignancy that originates from the retina. In 1971, Knudson proposed his two-hit hypothesis, which states that two mutational events are required to initiate tumor progression, sporadically or hereditarily. Aims. To characterize point mutations in the RB1 gene associated with retinoblastoma, thereby contributing to the understanding of the molecular mechanisms underlying disease development. Methods. We analyzed four-point mutations in retinoblastoma, one synonymous mutation (pA14A), two missense mutations (pN328H and pD718N), and one with an early termination codon (pR552*), to characterize their cellular and molecular effects. We studied their mRNA and protein expression levels, proliferation, viability, localization, and migration using an RBKO cell line. Results. All mutants were expressed at the mRNA and protein levels. Regarding the subcellular localization of the mutants, pN328H was restricted to the nucleus, while pA14A, pR552*, and pD718N were present in both the nucleus and cytoplasm. The assays comparing the viability, proliferation, and migration of all variants versus wild-type RB showed significant alterations, particularly in mutant pR552*, which showed remarkable changes. The construct pR552* lacking the HA tag was generated. Once stably transfected, it was confirmed that the observed effects did not depend on the tag. Remarkably, the co-expression of both pR552* and wild-type RB showed that the pR552* mutant alone is sufficient to maintain the mutant phenotype. Conclusions. Our results suggest that the pR552* mutant exhibits gain-of-function (GOF) characteristics, as it not only loses its typical suppression function but also generates effects that alter cellular behavior.